三聚氰胺 ELISA检测试剂盒说明书

三聚氰胺 ELISA检测试剂盒说明书
（中文仅供参考，请以英文说明书为主）
1.概述
此试剂盒的原理是酶联免疫测定法，这个试剂盒可用于一切样品中三聚氰胺的定性或定量检测。如果需要进一步测定可以利用HPLC, GC/MS技术。
2.安全指导
试剂盒标准中含有少量的三聚氰胺，另外，底物溶液中含有四甲基联苯胺，终止液里含有稀释的盐酸。尽量避免不要和这些试剂接触，如果这些试剂接触到皮肤请马上用水冲洗。
3.存储和稳定性
试剂盒应在 4–8℃保存，在使用前试剂盒内的所有试剂都要回温到室温(20-25℃)在有效期内试剂可以一直使用
4．原理
酶联免疫吸附测定法定量测定三聚氰胺残留。将标准、样品提取物和三聚氰胺酶标记物加入到已经包被有三聚氰胺抗体的微孔中开始反应。在30分钟的孵育过程中，样品萃取物中的三聚氰胺与三聚氰胺酶标记物竞争结合微孔中的三聚氰胺抗体，孵育30分钟后洗掉微孔中所有没有结合的三聚氰胺及三聚氰胺酶标记物。在用稀释的洗液清洗结束后，每孔中加入清澈的底物溶液，结合的酶标记物将无色的底物转化为蓝色的物质。孵育20分钟后停止此反应，根据各孔颜色深浅进行数据读取。依据标准的颜色得出样品中三聚氰胺的的浓度值。
5.局限性
我们已经对可能出现在检测样品中的很多有机和无机物做了检测，发现它们不和这个试剂盒发生交叉反应。然而在样品中也有一些易变质的化合物，它们通过基质影响来干扰测定，如含脂肪的食品，它们在测定前要通过稀释来消除一些基质影响。在使用的过程中出现失误也会影响结果，例如试剂盒存储的条件、吸取液体的程序、吸取液体的不准确、在发生免疫和底物反应的过程中孵育时间不准确。
6．工作数据
敏感性：三聚氰胺检测限10 μg/L，B/B0为50%时的值为150 μg/L，测定结果在标准曲线的中间是最精确的。
重复性：
标准的变异系数(CVs) <10%; 样品的变异系数（CVs）<15%.
特异性：



7．样品制备
湿的宠物食品萃取方法（稀释倍数：100）
1、 均质样品至布丁状。
2、 称取2g样品加入10mL 60%甲醇/水溶液，并剧烈振荡。
3、 超声萃取1分钟。
4、 漩涡混合1分钟，然后静置5分钟，使样品分层。
5、 3000 g 室温离心5分钟。
6、 用玻璃纤维滤纸过滤上清液，并将萃取液收集于一干净试管中。
7、 用样品稀释液将滤液20倍稀释（如：0.1mL滤液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS）
8、 移取150 ul 进行分析。
注意：用此方法测定了8个添加有15ppm三聚氰胺的猫粮（非要求召回），回收率范围为75%-117%。本方法只可作为样品筛选方法，不可作为最终确认方法。
小麦面筋蛋白萃取方法：（稀释倍数：500）
1.均质或混匀小麦面筋蛋白样品。
2.称取0.2g均质好的样品加入10mL 酸化的60%甲醇/水溶液(1mL 1N HCl/ 100mL 60%甲醇/水)。
3.漩涡混合并超声萃取，使样品溶解（确保样品中没有结块）。
4.用样品稀释液稀释萃取液按照1:10比例。（0.5mL+4.5mL 10%MeOH/20 mM PBS）。
5.10000转/分离心上清液10分钟。
6.用G6玻璃纤维滤纸过滤上清液，并将萃取液收集于一干净试管中。
7.移取150 ul 进行分析。
注意：如果样品中含有大量的添加物，需要加入更大量的萃取溶液，以保证萃取效率。操作人依据自己的判断力，如果测试结果比较高，需要加入两倍的萃取溶液（0.2/20mL），进行二次测定。
干的宠物食品萃取方法（稀释倍数：200）
1.质器均质干的宠物饲料样品。
2.称取1g样品加入10mL 60%甲醇/水溶液，并剧烈振荡。
3.超声萃取1分钟。漩涡混合1分钟，然后静置5分钟，使样品分层。
4.3000 g 室温离心5分钟。
5.用G6玻璃纤维滤纸过滤上清液，并将萃取液收集于一干净试管中。
6.用样品稀释液将滤液20倍稀释（如：0.1mL滤液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS）
7.移取150 ul 进行分析。
婴儿配方奶粉样品前处理方法：（稀释倍数：15）
1.称取2g样品加入6mL 样品萃取液，剧烈震荡两分钟。
3.3000g室温离心5分钟。
4.取上清液过玻璃纤维滤纸，收集滤液
5.将滤液用样品稀释液1：5稀释，（取0.2ml滤液到0.8ml稀释液中），
6.取150ul测定。
注:样品萃取液：称85g氯化钠定容到1L,摇匀，取出25ml加入25ml蒸馏水，再加入50ml100%甲醇，摇匀样品稀释液：0.31g磷酸二氢钠+2.87g磷酸氢二钠定容到1L,加入100ul吐温20，摇匀

液态奶样品前处理方法：（稀释倍数：50）
1.取1ml鲜牛奶，加入4ml 60%甲醇/20mMPBS，混合
2.3000g转室温离心5分钟。
3.取100ul上清液加入到0.9ml10%甲醇/20mMPBS中，混合均匀，取150ul测定。
三聚氰胺饲料前处理：（稀释倍数：20）
1. 称1g饲料，4ml甲醇。
2. 加0.1gNaCl。
3. 全负荷涡旋混合5分钟，4000转离心10min。
4. 取0.2ml上清液加入0.8ml 20mMPBS，混匀。
5. 取150 ul测定。
A 试剂盒组成
1、真空包装微孔板（8×12条），包被有三聚氰胺多克隆抗体
2、6瓶三聚氰胺标准液，浓度分别为0、20、50、100、200、500ng/mL(ppb)
3、1瓶7mL 三聚氰胺酶标记物
4、1瓶14mL底物（TMB）
5、1 瓶14mL终止液.(注意:盐酸,勿接触皮肤!).
B 测试前准备
微量移液器和吸头是必须使用的，推荐使用排枪，在做同一次测试时要使用同一个盒子里的试剂和标准。
1、使用前将所有的试剂拿到室温（19℃-25℃）。
2、从铝箔袋中拿出要求数量的微孔条，放入干燥剂并重新封好袋子以免微孔条受潮。置于4-8℃保存。
3、标准液，酶结合物，底物，终止液不用稀释直接使用。
4、洗液在使用前要以1：5的比例稀释后使用。
5、由于终止液中包含盐酸拿的时候要小心。
6、洗液清洗液：0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl,蒸馏水定容至1000ml+0.5ml土温20。
7、20mM PBS： 0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl ,蒸馏水定容至1000ml。
C. 步骤
1、在对应的微孔中加入100 μL 标准或样品。最好做重复。
2、用排枪在每个孔中都加入50μL酶标记物、然后用纸片盖住微孔，轻轻震荡微孔板30秒使孔中的液体混匀。
3、在室温下孵育30分。
4、将孔里的液体倒入合适的容器中，每个微孔至少加入250μL、1×洗液，然后弃掉洗液到合适的容器中，重复洗3次。在一层厚的吸水纸上拍板，去掉残留的洗液。
5、使用排枪在每个孔中加入100μL底物显色液，在室温孵育20分。尽量使其不见光。
6、每孔加入100μL终止液，板中颜色将会由蓝色变为棕黄色。
7、450nm 下读取每个孔的吸光度值（OD）。
D. 结果评估
可以利用商业ELISA软件程序比如Logit/Log or 4-Parameter 来评价ELISA结果。也可
以通过计算每个标准的%B/B0值，以%B/B0为y轴、三聚氰胺浓度为x轴作一标准曲线。样品浓度可以通过标准曲线来计算。当样品中的三聚氰胺浓度高于标准5（500μg/L）时，需要稀释后重新再测定来获得更精确的结果。
半定量结果的判定，可根据样品的吸光度值与标准的吸光度值来判定，样品的吸光度值低于某个标准的吸光度值，则说明样品的三聚氰胺含量大于此标准的浓度，样品的吸光度值高于某个标准的吸光度值，则说明样品的三聚氰胺含量小于此标准的浓度。
E． 还需设备
1、50μL ～200μL 单道或多道移液器和吸头
2、微孔板洗涤机
3、振荡器
4、蒸馏水或去离子水
5、吸水纸
6、离心机
7、450nm 滤光片的酶标仪
F. 工作计划
Std 0-Std 5: 标准 (0; 20; 50; 100; 200; 500 ppb)
Sam1, Sam2, etc.: 样品
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Std0 Std4 etc
B Std0 Std4 etc
C Std1 Std5 etc
D Std1 Std5 etc
E Std2 Sam1
F Std2 Sam1
G Std3 Sam2
H Std3 Sam2







G 标准曲线